Cell 子刊：孤独症机制新发现——CHD8单倍不足影响兴奋性和抑制性神经元发育轨迹
染色体域解旋酶DNA结合蛋白8(CHD8)基因突变是导致自闭症谱系障碍(ASD)的一个重要的危险因素，但CHD8单倍不足如何影响神经发育仍然未知。
2022年4月5日CN研究团队在Cell Reports杂志发表文章，题为CHD8 haploinsufficiency alters developmental trajectories of human excitatory and inhibitory neurons linking autism,文章报道，在人脑中，CHD8单倍不足扰乱了神经发育轨迹，分别加速和延迟了抑制性和兴奋性神经元的产生，在第60天和第120天，成比例对称相反的扩增，这种失衡可能与ASD患者的大头畸形相关。
研究人员通过患者特异性突变和马赛克类器官的等位基因设计，定义了基因型-表型关系，并解释了他们的细胞自主性。研究结果表明，细胞类型特异性CHD8依赖的分子缺陷，与异常的增殖和选择性剪接程序有关。
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1. CHD8杂合突变导致
脑类器官大小增加
图一：CHD8杂合突变导致的脑器官大小增加
在优化了前人hESC的培养条件之后，研究人员发现，随着时间的进展，类器官的大小随之增加，mRNA表达水平检测发现，CHD8表达水平最高，这表明CHD8可能在此发育阶段发挥重要作用。
接下来，研究人员在基于转录组学的疾病建模基准的基础上，采用等基因实验设计，利用簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因组工程技术在hESC系等基因中引入CHD8突变。培育了两个独立的hESC株(CHD8+/-和CHD8+/-；GFP)和两个携带导致密码子提前终止的患者特异性突变的细胞系（S62X和E1114X）。其中，S62X患者虽出现ASD核心症状，但无头颅畸形和智力残疾。
研究人员将CHD8突变与eGFP荧光蛋白表达偶联，即CHD8+/-；GFP，CHD8+/E1114X；GFP，CHD8+/S62X；GFP，将这些携带选定CHD8突变的人胚胎干细胞分离、扩增，并分析潜在的靶外效应，通过免疫印迹和qPCR检测突变对CHD8蛋白和mRNA水平的影响。结果证实，所有突变体均表现出CHD8蛋白和mRNA表达水平降低。
图二：大脑类器官再现了神经源性谱系
2. 大脑类器官能够再现神经源性谱系
为了明确CHD8单倍不足的细胞机制，研究人员应用单细胞RNA-seq（scRNA-seq）对20天、60天、120天这三个不同发育阶段进行测序。并结合已知细胞标记应用Leiden算法，将其按照时间关系及细胞群体演化分为10个细胞群，其中包括放射状胶质细胞簇、兴奋神经元、中间神经元及少量未知细胞。
通过树图分析，研究人员发现，与对照组相比，尽管大脑类器官在神经前体细胞阶段，兴奋性和抑制性谱系通过这种方法没有被分解为单独的种群，但这些谱系在它们的分化过程中表现出从祖细胞到神经元的典型的拟时间进程且每个神经元群体在整个阶段丰度的增加都与预期相匹配。
图三：CHD8单倍不足导致细胞数量比例的一过性异常和神经元间的早熟分化
3. CHD8单倍不足导致细胞数量比例的
一过性异常和神经元间的早熟分化
为了明确CHD8单倍不足对皮质发育的影响，研究人员重点研究了3个CHD8的突变株，CHD8+/-,CHD8+/-;GFP和CHD8+/E1114X，它们的表型与大脑类器官过度生长导致的巨头畸形一致。通过拟时间跟踪发育的分支，研究人员发现，突变细胞株第60天的中间神经元分支和第120天的兴奋神经元分支表达丰度较高。
研究人员分别计算了突变组和对照组在每个阶段的前三个拟时间成分，从而分析每个阶段最相似的三个拟时间成分。该分析显示，在对照组中，前两个最有可能的轨迹提示产生两个不同的兴奋性神经元簇，而在突变组中，第二个最有可能的轨迹预测中间神经元的产生，这证实了CHD8单倍不足能够加速中间神经元的发育，从而在第60天产生更高比例的中间神经元。
图四：携带CHD8突变的脑器官类细胞增殖增加并持续
4. 携带CHD8突变的脑器官类细胞
增殖增加并持续
考虑到CHD8的功能和在CHD8突变类器官中观察到的表型，研究人员对10日龄的脑类器官进行了转录分析，结果发现这是细胞增殖的丰富阶段，且标志着CHD8+/+和CHD8+/-首次分离。
为了评估体积增大和神经发生延迟是否是由于神经前体细胞增殖不平衡导致，研究人员利用免疫组化和基于深度学习的免疫标记细胞半自动计数，对不同类型的细胞进行定量分析发现，在CHD8+/-样本中EDU-和KI67-阳性细胞明显多于对照组，结果表明，在第10天，并持续到第20天，CHD8突变与增殖细胞数量的增加有关。
图五：CHD8单倍不足导致细胞自主缺陷
5. CHD8单倍不足导致细胞自主缺陷
为了了解CHD8单倍不足的影响是否是细胞自主的，研究人员采用对照组CHD8+/+、GFP-CHD8突变体(CHD8+/-；GFP)、CHD8Mix(CHD8+/+/CHD8+/-；GFP)，并对其中的EGFP阳性或阴性祖细胞(SOX2阳性)和神经细胞(NeuN阳性)进行计数。
结果表明CHD8Mix在第60天时具有细胞自主表型，且CHD8+/+组Sox2+/GFP+细胞比例高于Sox2+/GFP-，而CHD8突变神经细胞的比例低于野生型细胞。这表明杂合CHD8LoF突变会导致人脑器官中神经前体细胞自主持续增殖。
图六：CHD8突变型脑器官细胞类型特异性基因表达缺陷
6. CHD8突变型脑类器官细胞类型
特异性基因表达缺陷
根据与ASD基因在人类新皮质特定发育阶段的功能收敛，以及在人类胎中期大脑中CHD8靶点周围的共表达网络，研究人员观察到ASD相关顶级基因在DEG中显著富集。GO分析显示，上调的基因在与细胞周期调节、RNA剪接和转录调节相关的术语上富集，下调的基因则在神经元分化和脑发育相关的术语富集。
在下调和上调的基因中，分别有28%和47%被报告为CHD8结合，这表明CHD8单倍不足的直接影响。且对下调基因的GO-term富集显示，间接靶标富含神经发生调控，直接靶标富含染色质修饰物和转录调节因子。这表明，在祖细胞中，CHD8直接作用于基因调控，间接作用于神经发生。
随后，研究人员对比与大头畸形相关的突变体与对照品系，交叉验证批量和单细胞RNA序列，将分析扩展到单细胞水平，发现第10天上调和下调的基因在第20天映射到不同细胞簇的DEG上，前者在放射状胶质细胞循环富集，而后者则在分化过程中进一步聚集。研究人员进一步对特定细胞类型中异常表达的基因的功能进行注释，并进行GO富集分析。
发现第20天，在放射状胶质细胞簇中排名前20位的DEG中，ZEB2（在皮质扩张中发挥作用）显著低于对照组，染色质免疫沉淀测序（ChIP seq）与此结果一致。ZEB2编码一种转录因子，促进神经上皮分化为放射状胶质细胞，从而确定增殖细胞的初始数量，从而控制皮质组织扩张。ZEB2可能是CHD8单倍功能不足对神经干细胞增殖动力学影响的潜在介体。
总 结
CHD8单倍不足通过促进抑制性神经元的加速生成和兴奋性神经元的延迟产生而扰乱神经发育轨迹，并对放射状胶质细胞的增殖产生时间受限的细胞类型特异性影响。
参考文献
Villa CE, Cheroni C, Dotter CP, López-Tóbon A, Oliveira B, Sacco R, Yahya AÇ, Morandell J, Gabriele M, Tavakoli MR, Lyudchik J, Sommer C, Gabitto M, Danzl JG, Testa G, Novarino G. CHD8 haploinsufficiency links autism to transient alterations in excitatory and inhibitory trajectories. Cell Rep. 2022 Apr 5;39(1):110615. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110615. PMID: 35385734.
编译作者：zouki（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）